Membuat preparat kromosom seringkali diperlukan untuk mengetahui ploidi (set kromosom) ikan. Teknik ini akan menghasilkan data yang lebih “valid” dibandingkan dengan preparasi nukleolus (“valid” yang saya maksudkan adalah bahwa semua tergantung pada ketelitian dan kehati-hatian dalam melakukan preparasi), namun memerlukan sedikit “keahlian” lebih (ini pun relatif). Dan karena media kulturnya juga cocok untuk bakteri, maka sterilisasi alat-bahan-laboran menjadi salah satu kunci teknik ini. Prosedur ini pun telah saya cobakan untuk beberapa ikan (mas, nila, patin, gurame, lele, sidat, dan saya sendiri) terutama jika akan dilanjutkan untuk membuat karyotipe.

Membuat preparat kromosom - ilustrasi kromosom Adi Sucipto

Alat, bahan dan prosedur tentang preparasi kromosom hasil kultur darah sejauh yang saya tahu; hingga kini sangat banyak. Media untuk kultur pun sudah banyak mengalami penyederhanaan. Prosedur-prosedur lainnya dapat Anda temukan di buku “working with animal chromosomes”.

Alat-alat yang digunakan sesuai gambar yang akan ditampilkan di akhir tulisan, adalah sebagai berikut:

  1. Sentrifuse untuk mempercepat pengendapan suspensi sel
  2. pH meter untuk mengukur tingkat keasaman media kultur
  3. Botol-botol media (kap. 15 ml) tahan panas sampai 100 oC untuk tempat media dan kultur darah
  4. Syringe 1,3 dan 10 ml dengan no. jarum 21, 23 atau 26, untuk memindahkan bahan-bahan dalam bentuk cair dan pengambilan darah
  5. Pipet tetes untuk membuatan preparat
  6. Kaca objek untuk pembuatan preparat
  7. Kaca penutup untuk pembuatan preparat
  8. Minyak emersi untuk pembuatan preparat
  9. Tabung alat sentrifuse untuk tempat sel saat sentrifuse
  10. Tabung eppendorf (kap. 1,5 ml) untuk tempat suspensi sel setelah disentrifuse
  11. Filter (millipore 0,2 mm) untuk memfilter bakteri
  12. Lampu bunsen dan korek api untuk membuat nyala api saat inokulasi
  13. Termometer untuk pengukur suhu
  14. Ruang steril untuk menghindari kontaminasi (terutama bakteri)
  15. Inkubator untuk inkubasi kultur darah
  16. Timbangan dengan satuan gram, digit dibelakang koma) untuk menimbang bahan
  17. Mikroskop binokuler (dengan kamera dan atau TV) untuk pengamatan kromosom
  18. Stopwach untuk pengukur pergerakan waktu
  19. Lampu UV untuk sterilisasi alat dan bahan
  20. Autoklaf (sampai 100 oC) untuk sterilisasi madia dan botol kultur

 

Adapun bahan-bahan yang diperlukan antara lain:

  1. Kolkisin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) untuk memutus gelendong pembelahan sel pada saat metafase
  2. KCl, bahan pembuat larutan hipotonik (KCl 0,075 M)
  3. Asam asetat glasial dan etanol, bahan larutan Carnoy
  4. MS 222, untuk pembiusan sampel ikan
  5. Alkohol 70% untuk sterilisasi alat-alat, wadah bahan dan ruang aseptik
  6. Serum (FBS = fetal bouvine serum atau FCS = fetal calf serum), bahan untuk media kultur darah
  7. L-Glutamin, bahan untuk media kultur darah
  8. HEPES (Sigma), buffer
  9. Eagle’s MEM (Nissui 1), bahan untuk media kultur darah
  10. Na-Heparin, anti koagulan
  11. PHAM (phytohemaglutinin-M), sebagai protein asing dalam kultur (memacu pembelahan sel)
  12. Akuades, pelarut
  13. NaOH 0,1 N untuk menaikkan pH media hingga netral
  14. Akuabides, pelarut media
  15. NaCl, pembuatan larutan fisiologis (0,9% NaCl)
  16. Giemsa, pewarnaan kromosom
  17. Ikan ukuran >8 cm, ikan uji

 

Prosedur Kerja

  1. Mempersiapkan alat dan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan media kultur darah,
  2. Membuat media kultur dengan melarutkan 0,3 gram HEPES (Sigma) dan 0,94 gram Eagle’s (Nissui 1) dalam 100 ml akuades. Larutan yang terbentuk diatur pH-nya pada 7,3 dengan menambahkan NaOH 0,1 N, kemudian dibagi menjadi 4 ml dalam botol-botol media berkapasitas 15 ml.
  3. Menyterilisasi botol-botol berisi media dalam oven/autoclav suhu 100 oC selama 1 jam. Jika proses akan dihentikan, botol berisi media kultur dapat disimpan dalam freezer sampai saat akan digunakan.
  4. Pembuatan media selanjutnya dilakukan di dalam ruang aseptic. Sebelum digunakan, ruangan ini disemprot dengan alcohol 70 % dan diradiasi dengan lampu ultra violet selama sekitar 1 jam. Alat dan bahan yang diperlukan dalam pembuatan media selanjutnya adalah syringe 1 ml dan 10 ml serta jarumnya, filter millipore 0,22 mm, lampu Bunsen, korek api, botol-botol yang telah berisi campuran akuabides-HEPES-MEM-NaOH, akuabides, Na-Heparin, FBS, L-Glutamin, tissue dan PHA-M. Tangan, alat-alat dan wadah bahan yang dimasukkan ke dalam ruang aseptic didesinfeksi dengan alcohol 70 %.
  5. Membuat stok media setengah jadi yang terdiri dari campuran (1) PHA-M dengan 5 ml akuabides, (2) 20 miligram L-Glutamin dengan FBS dan (3) 10 miligram Na-Heparin dengan 10 ml Ringer’s. Dari campuran bahan nomor (1), (2) dan (3) masing-masing diambil 0,1 ml,1 ml dan 0,1 ml dengan menggunakan syrenge yang telah dipasangi filter untuk kemudian memasukkannya ke dalam botol media. Pembuatan dan pengambilan ketiga campuran bahan, dilakukan di atas lampu Bunsen di dalam ruang aseptic.
  6. Mengambil darah ikan sebanyak 0,3-0,5 ml dengan cara menusukkan jarum syrenge yang telah berisi 0,1 ml Na-Heparin pada pembuluh darah dorsal sekitar pangkal ekor.
  7. Tetesan pertama darah dalam alat suntikan dibuang, sedangkan dua tetes berikutnya dimasukkan ke dalam botol media di atas nyala api Bunsen untuk kultur leukosit.
  8. Darah yang dikultur diinkubasi dalam incubator bersuhu 28 ± 0,5 oC selama tiga sampai empat hari.
  9. Menggoyang botol media setiap hari selama inkubasi untuk mengurangi terjadinya pengendapan sel darah yang dikultur.
  10. Memanen sel darah putih yang dikultur pada hari ke tiga dan ke empat. Dua jam sebelum panen, ke dalam media ditambahkan 2-3 tetes kolkisin 20 %(w/v). Setiap 30 menit, media digoyang-goyang agar kolkisin bekerja lebih merata.
  11. Memasukkan suspensi sel yang terbentuk ke dalam botol sentrifuse untuk kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit.
  12. Supernatan yang terbentuk dibuang dan diganti dengan larutan hipotonik KCl 0,075 M sebanyak 4 ml serta dibiarkan selama 1 jam sambil diaduk dengan hati-hati setiap 15 menit.
  13. Menambahkan 2 ml larutan Carnoy dan disentrifuse kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama seperti pada point 11. Proses sentrifuse dan pembuangan supernatan diulangi 2 kali, masing-masing setelah tabung sentrifuse diisi dengan larutan Carnoy sebanyak 5 dan 4 ml.
  14. Endapan yang terbentuk hasil sentrifuse terakhir, difiksasi kembali dengan larutan Carnoy sebanyak 1-1,5 ml.
  15. Memindahkan stok suspensi sel darah ke dalam tabung kecil (eppendorf). Stok suspensi sel ini dapat disimpan dalam refrigerator dan diaduk dengan pipet jika akan digunakan.
  16. Pembuatan preparat dilakukan dengan cara meneteskan suspensi sel di atas gelas objek bersih dari ketinggian sekitar 15-20 cm. Preparat dibiarkan kering udara.
  17. Mewarnai preparat dengan Giemsa 20 % selama 20 menit dalam suhu ruang. Pewarnaan dilakukan dengan cara menetestakn Giemsa di atas preparat sehingga menutupi seluruh permukaannya atau dengan cara mencelupkan gelas objek kedalam box pewarnaan yang berisi Giemsa.
  18. Mengamati preparat dengan bantuan mikroskop pembesaran 100, 400 dan 1000 kali.
Membuat preparat kromosom ikan
Tagged on: